在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，食品安全始終是公眾關(guān)注的焦點。其中，由致病性弧菌（Vibrio）引起的食源性疾病不僅對消費者健康構(gòu)成威脅，還對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟造成了巨大損失。傳統(tǒng)的檢測方法往往耗時且靈敏度不足，難以滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。然而，最近一項研究開發(fā)出了一種結(jié)合免疫磁珠分離（IMBS）和對流PCR（CPCR）的新型檢測技術(shù)，為解決這一問題帶來了曙光。
技術(shù)背景與需求
弧菌是一類廣泛存在于水環(huán)境中的革蘭氏陰性細菌，其中一些種類如副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等具有致病性，能夠引發(fā)人類的腸胃炎、傷口感染等多種疾病。在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，弧菌的污染尤為常見，尤其是在養(yǎng)殖水體、飼料以及水產(chǎn)品中。由于弧菌的多樣性和快速傳播能力，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和PCR檢測方法在實際應(yīng)用中存在諸多局限性。微生物培養(yǎng)耗時長，通常需要數(shù)天才能得到結(jié)果；而傳統(tǒng)PCR需要復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)人員操作，難以在現(xiàn)場快速應(yīng)用。因此，開發(fā)一種快速、靈敏且適合現(xiàn)場使用的檢測技術(shù)迫在眉睫。
免疫磁珠分離-對流PCR技術(shù)的開發(fā)
最近，寧波大學(xué)的研究團隊開發(fā)了一種名為免疫磁珠分離-對流PCR（IMBS-CPCR）的新型檢測技術(shù)，專門用于現(xiàn)場快速檢測水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的四種致病性弧菌：溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）。該技術(shù)的核心在于結(jié)合了IMBS和CPCR兩種先進技術(shù)。
CPCR是一種基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)的改進方法，通過利用流體密度差實現(xiàn)反應(yīng)物在冷熱區(qū)域之間的持續(xù)循環(huán)，從而無需主動泵送即可完成核酸擴增。與傳統(tǒng)PCR相比，CPCR設(shè)備更加便攜，試劑消耗更少，且操作簡便，特別適合現(xiàn)場檢測。在本研究中，研究人員針對四種弧菌分別優(yōu)化了CPCR的退火溫度、延伸溫度、反應(yīng)時間和引物濃度等條件，確保了檢測的準確性和靈敏度。
圖1 免疫磁珠條件優(yōu)化結(jié)果。(A)、(B)、(C) 分別代表抗原濃度、磁珠濃度和磁珠富集時間的優(yōu)化百分比。不同顏色代表四種不同的弧菌。點代表平均值，誤差線代表標(biāo)準差。
免疫磁珠分離技術(shù)則是利用與磁性微球結(jié)合的特異性抗體，能夠高效地從復(fù)雜樣本中富集目標(biāo)細菌。在本研究中，研究人員通過優(yōu)化抗體用量、磁珠濃度和捕獲時間等條件，實現(xiàn)了對目標(biāo)弧菌的高效率捕獲，捕獲率高達82.6%至83.3%，而非目標(biāo)細菌的捕獲率則低于11%。這一技術(shù)的優(yōu)勢在于其高特異性和高靈敏度，能夠在低濃度下檢測到目標(biāo)細菌，最低檢測限可達10 CFU/mL。
圖2 免疫磁珠對靶標(biāo)細菌和非靶標(biāo)細菌的捕獲率。細菌被分為兩組：靶標(biāo)細菌（四種弧菌）和非靶標(biāo)細菌。星號表示靶標(biāo)細菌和非靶標(biāo)細菌的捕獲率之間存在顯著差異（P<0.01）。所有實驗均重復(fù)三次，誤差線表示標(biāo)準差。
技術(shù)優(yōu)勢與應(yīng)用前景
IMBS-CPCR技術(shù)的結(jié)合，不僅提高了檢測的靈敏度和特異性，還大大縮短了檢測時間。與傳統(tǒng)的直接CPCR或PCR方法相比，該技術(shù)在模擬魚樣中的檢測靈敏度提高了10至100倍。此外，該技術(shù)還具有便攜性強、操作簡便、成本低等優(yōu)點，特別適合在水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場、食品加工企業(yè)和海關(guān)等場所快速檢測弧菌污染。
在實際應(yīng)用中，研究人員通過模擬魚樣實驗驗證了IMBS-CPCR技術(shù)的有效性。實驗結(jié)果表明，該技術(shù)能夠在低至101 CFU/mL的濃度下檢測到目標(biāo)弧菌，且與傳統(tǒng)PCR的結(jié)果一致，證明了其準確性和可靠性。此外，該技術(shù)還能夠有效區(qū)分目標(biāo)弧菌和其他非目標(biāo)細菌，避免了誤報和漏報的可能性。
圖3 使用免疫磁珠分離 - 對流聚合酶鏈式反應(yīng)（IMBS-CPCR）和免疫磁珠分離 - 聚合酶鏈式反應(yīng)（IMBS-PCR）檢測四種弧菌的結(jié)果對比。圖例顯示了四種弧菌的濃度，單位為 CFU/mL（菌落形成單位 / 毫升）。顏色的深淺代表在不同濃度下目標(biāo)弧菌的富集能力。顏色越深，表明可檢測到的弧菌濃度越高，對應(yīng)較低的靈敏度；反之，顏色越淺，表明可檢測到的弧菌濃度越低，對應(yīng)較高的靈敏度。所有實驗均進行了三次重復(fù)。
結(jié)論與展望
IMBS-CPCR技術(shù)的開發(fā)為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌檢測提供了一種全新的解決方案。該技術(shù)結(jié)合了免疫磁珠分離的高特異性和對流PCR的快速檢測能力，具有顯著的現(xiàn)場應(yīng)用優(yōu)勢。未來，隨著技術(shù)的進一步優(yōu)化和商業(yè)化推廣，IMBS-CPCR有望在更廣泛的食品安全檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用，為保障公眾健康和促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮重要作用。
參考文獻：Zhang W, Yang Y, Kong F, et al. Development and optimization of immunomagnetic bead separation-convective PCR (IMBS-CPCR) for on-site detection of four common Vibrio species in aquaculture[J]. LWT, 2024, 211: 116928.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
