在食品安全備受關(guān)注的當(dāng)下，肉類中的沙門氏菌污染問題成為公眾焦點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因沙門氏菌感染導(dǎo)致9380萬病例，15.5萬人死亡，在菲律賓，它更是食物中毒爆發(fā)的主要微生物原因。傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)費(fèi)力，新型分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其中，一種基于鈣黃綠素的封閉管環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法脫穎而出，為肉類沙門氏菌檢測(cè)帶來新希望。
傳統(tǒng)檢測(cè)困境：耗時(shí)費(fèi)力且昂貴
傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)方法一直被視為檢測(cè)沙門氏菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但它需要經(jīng)過一系列復(fù)雜的生化和血清學(xué)測(cè)試，整個(gè)過程至少需要6天，耗費(fèi)大量人力、物力和時(shí)間。分子檢測(cè)技術(shù)如常規(guī)PCR雖然能實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)且耗時(shí)較短，但需要昂貴的設(shè)備、試劑以及專業(yè)技術(shù)人員操作，成本高昂。血清學(xué)檢測(cè)方法雖有快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但易受批次差異、交叉反應(yīng)影響，準(zhǔn)確性欠佳。這些問題在發(fā)展中國(guó)家尤為突出，迫切需要一種更高效、低成本的檢測(cè)方法。
LAMP技術(shù)
LAMP技術(shù)由Notomi等人在2000年開發(fā)，為沙門氏菌檢測(cè)開辟了新途徑。它使用4-6種獨(dú)立引物和Bst DNA聚合酶，在60-65℃的恒定溫度下就能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，相比常規(guī)PCR，反應(yīng)速度更快，能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量產(chǎn)物。而且，LAMP檢測(cè)可以在封閉管內(nèi)完成，減少了開蓋操作帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)，還能通過比色、熒光或濁度等可視化方式直接判斷結(jié)果，操作簡(jiǎn)單便捷，特別適合小型實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
LAMP檢測(cè)優(yōu)化：更靈敏、更精準(zhǔn)
研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)肉類樣本，對(duì)基于鈣黃綠素的封閉管LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化。在反應(yīng)體系中，精確調(diào)整了鈣黃綠素、MnCl2和MgSO4的濃度，最終確定為64μM、1mM和5mM，使檢測(cè)結(jié)果在擴(kuò)增后呈現(xiàn)出明顯的顏色差異，陰性為橙色，陽(yáng)性為綠色，便于肉眼觀察。同時(shí)，添加甜菜堿有效減少了非特異性擴(kuò)增，提高了檢測(cè)的特異性。優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)在65℃反應(yīng)60分鐘，后續(xù)可選擇80℃處理2分鐘使酶失活，整個(gè)流程高效且穩(wěn)定。
性能遠(yuǎn)超常規(guī)PCR
經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)展現(xiàn)出卓越性能。在特異性方面，對(duì)多種沙門氏菌血清型和非沙門氏菌菌株檢測(cè)時(shí)，只有沙門氏菌菌株出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，證明其引物特異性良好。在靈敏度上，更是優(yōu)于常規(guī)PCR。對(duì)于DNA稀釋系列，LAMP檢測(cè)能檢測(cè)到低至10?5稀釋度的DNA，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍；在純細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)中，LAMP檢測(cè)的最低檢測(cè)限為4.8×103 CFU/mL，相比常規(guī)PCR的4.8×107 CFU/mL，靈敏度提升了1000倍。
圖1 腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）DNA 系列稀釋后的 LAMP 和 PCR 擴(kuò)增結(jié)果。(A) LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性管呈橙棕色，陽(yáng)性結(jié)果呈黃綠色。(B - C) 使用 10,000× SYBR® Safe 核酸凝膠染色劑染色后，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察 LAMP 和 PCR 產(chǎn)物。試管和泳道 1 - 8：腸炎沙門氏菌腸炎亞種腸炎血清型 ATCC 49223M 的 DNA 從初始濃度 347 ng/μL 開始，依次稀釋至10?8 , 10?7 , 10?6 , 10?5 , 10?4 , 10?3 , 10?2 , 10?1。泳道 L 和 M 分別為 1 kb 和 100 bp 的 DNA 標(biāo)志物。
在對(duì)341份生肉樣本的平行檢測(cè)中，當(dāng)LAMP檢測(cè)與常規(guī)培養(yǎng)富集方法結(jié)合時(shí)，對(duì)生雞肉、牛肉和豬肉樣本的檢測(cè)陽(yáng)性率均達(dá)到100%，與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，且顯著高于3小時(shí)縮短富集方案與LAMP檢測(cè)結(jié)合的陽(yáng)性率。這表明優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)在結(jié)合常規(guī)培養(yǎng)方法時(shí)，能更靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)出肉類中的沙門氏菌。
圖2. 對(duì)341份生雞肉、牛肉和豬肉樣本（n=341）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，3小時(shí)縮短富集結(jié)合閉管LAMP檢測(cè)（3小時(shí)LAMP）、常規(guī)培養(yǎng)結(jié)合優(yōu)化閉管LAMP檢測(cè)（培養(yǎng)-LAMP）以及常規(guī)培養(yǎng)結(jié)合PCR檢測(cè)（培養(yǎng)-PCR）的陽(yáng)性率。
前景展望
這種優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)方法為肉類沙門氏菌檢測(cè)提供了一種強(qiáng)大的補(bǔ)充或替代手段，不僅靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且操作簡(jiǎn)便、成本較低，適合在資源有限的環(huán)境中推廣應(yīng)用。未來，隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，有望縮短檢測(cè)前處理時(shí)間，簡(jiǎn)化上游操作步驟，降低檢測(cè)成本，為全球食品安全保障發(fā)揮更大作用。對(duì)于消費(fèi)者來說，這意味著能更快、更準(zhǔn)確地了解肉類食品安全狀況，減少因食用受污染肉類而患病的風(fēng)險(xiǎn)，讓餐桌更加安全。
參考文獻(xiàn)：Balaga K B, Pavon R D N, Calayag A M B, et al. Development of a closed-tube, calcein-based loop-mediated isothermal amplification assay to detect Salmonella spp. in raw meat samples[J]. Journal of Microbiological Methods, 2024, 220: 106922.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
