全球食品安全警報每年都在拉響。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計顯示，食源性致病菌導(dǎo)致約6億人患病、42萬人死亡，直接經(jīng)濟損失超千億美元。其中，大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和蠟樣芽孢桿菌是最常被通報的三大“元兇”，潛伏在生鮮蔬菜、巴氏奶、即食肉類等各類日常食品中。傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)——培養(yǎng)法——需要2～5天才能確認(rèn)結(jié)果，且會把已死亡或受傷的細(xì)菌也判定為陽性，造成過度召回；而近年普及的qPCR雖將時間縮短至6～8小時，卻必須依賴溶菌酶、玻璃珠或柱式試劑盒進行細(xì)胞破壁與DNA純化，操作繁瑣、成本高，基質(zhì)干擾嚴(yán)重時靈敏度驟降，漏檢風(fēng)險隨之增加。面對供應(yīng)鏈快速流轉(zhuǎn)與“從農(nóng)場到餐桌”全程監(jiān)控的雙重壓力，行業(yè)亟需一種既能在復(fù)雜食品基質(zhì)中精準(zhǔn)捕捉“活菌”、又能在一餐飯時間內(nèi)給出可靠結(jié)論的新技術(shù)。噬菌體——自然界中專一感染并裂解活細(xì)菌的病毒——因其對死菌“視而不見”且自帶高效裂解酶系統(tǒng)，成為破局關(guān)鍵。
近日，韓國食品研究員林正愛研究員和林敏哲研究員及其團隊在Food Control發(fā)表題為“Bacteriophage-assisted lysis and eluted genomic DNA-based detection of pathogenic bacterial contamination in food”的研究性論文。該研究提出了一種“噬菌體裂解+多重PCR”聯(lián)用技術(shù)，利用噬菌體裂解活菌釋放DNA，結(jié)合多重PCR，開發(fā)了一種快速、特異得多目標(biāo)檢測方法， 解決了傳統(tǒng)PCR無法區(qū)分活/死菌得問題，為食品中活致病菌的快速檢測提供了新策略。
圖1 文獻基本信息
為了把3–5天的傳統(tǒng)流程壓縮到一頓午飯的時間，團隊搭建了一條“噬菌體-PCR 閃電通道”。第一步，選毒。研究者從污水、土壤和腐敗蔬菜中分離并純化出三株烈性噬菌體：ΦO157、ΦSTM 和 ΦBc，分別對大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和蠟樣芽孢桿菌具有95%以上的宿主專一性。通過雙層瓊脂滴定與宿主范圍測試，確認(rèn)它們對死菌、非靶標(biāo)菌株無活性，天然排除“死菌干擾”。第二步，裂解。研究團隊把100 μL含有103–10? CFU/mL 活菌的食品濾液（生菜滲液、泡菜湯、牛奶、雞胸肉勻漿）與等體積“噬菌體雞尾酒”（MOI=10）混合，置于37 ℃、200 rpm 的恒溫振蕩器中孵育60 min。此時噬菌體完成吸附-注入-復(fù)制-裂解四連擊，宿主細(xì)胞膜被內(nèi)溶素精準(zhǔn)打孔，完整基因組DNA自動“快遞”到上清，無需任何額外溶菌酶或機械破壁。第三步，檢 DNA。直接取2 μL上清作為模板，加入針對stx1、invA和cesB基因的多重PCR體系（95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共 35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min）。為了適配現(xiàn)場，研究者還把反應(yīng)體系縮小至10 μL，讓便攜式PCR儀也能跑。全過程從取樣到電泳判讀被嚴(yán)格控制在5 h以內(nèi)。
圖2 使用噬菌體輔助裂解和多重PCR檢測食源性細(xì)菌的流程圖
實驗室內(nèi)，研究人員用三種靶標(biāo)菌和12種常見干擾菌（包括乳酸菌、酵母、腐敗假單胞菌等）進行交叉驗證，結(jié)果無一假陽性。靈敏度實驗顯示，在未富集狀態(tài)下，檢測限分別為大腸桿菌5×102 CFU/mL、沙門氏菌8×102 CFU/mL、蠟樣芽孢桿菌1×103 CFU/mL；如果先將樣品經(jīng)4 h的冷增菌（BPW，37 ℃），檢測限全部降至<10 CFU/mL，符合國際標(biāo)準(zhǔn)對即食食品的限量要求。在真實世界挑戰(zhàn)中，團隊從當(dāng)?shù)爻须S機采購120份樣品（生菜30、泡菜30、牛奶30、雞胸肉30），人工污染30%的樣本至10? CFU/mL。使用本方法，陽性檢出率100%，陰性對照無假陽性；而同期送檢的培養(yǎng)法需48 h，且因死菌干擾出現(xiàn)4%假陽性。針對復(fù)雜基質(zhì)，生菜葉綠素、泡菜高鹽、牛奶脂肪均未抑制PCR信號，回收率92–108%，CV<5%。最后，研究者把整套流程搬到一輛移動檢測車上，現(xiàn)場檢測20份外賣沙拉，結(jié)果與實驗室完全一致，耗時4 h 17 min。
本研究以“讓病毒為人類打工”的思路，把烈性噬菌體改造成天然靶向裂解試劑，輔以一步上清PCR，成功把食源性活致病菌的檢測從實驗室的3天壓縮到5小時以內(nèi)，既躲開了死菌的“假陽性陷阱”，又在生菜、泡菜、牛奶等復(fù)雜基質(zhì)中保持100%真陽性捕獲率。它用極簡流程、極低成本為全球食品安全鏈提供了可移動、可推廣、可實時的“閃電哨兵”，預(yù)示著未來從口岸到廚房都能實現(xiàn)“吃飯前先看病毒報告”的新常態(tài)。
參考文獻：Se-Min Kim, Eo-Jin Kim, Eun-Jin Jang, et al. Bacteriophage-assisted lysis and eluted genomic DNA-based detection of pathogenic bacterial contamination in food. Food Control 162 (2024)110433 DOI:10.1016/j.foodcont.2024.110433.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~陳富。
