推薦閱讀
- 壓縮空氣微生物采樣器在無菌灌裝線吹瓶機高壓氣體微生物采樣的應(yīng)用
- 環(huán)凱HandyPlate?測試片在方便面類食品檢測中的應(yīng)用
- HandyPlate?快速菌落總數(shù)測試片在調(diào)味品行業(yè)的應(yīng)用
- 浮游菌采樣器在醫(yī)院潔凈手術(shù)室的應(yīng)用
- GB4789.15-2016霉菌和酵母計數(shù)檢驗及注意事項
- GB4789.11-2014 β型溶血性鏈球菌檢驗及其注意事項
- 更新 | GB4789.10-2016金黃色葡萄球菌檢驗及其注意事項
- 更新 | GB4789.8-2016 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗及其注意事項
- 環(huán)凱生物酶底物法檢測系統(tǒng)(含質(zhì)控樣)-酶底物法檢測水中總大腸菌群、糞（耐熱）大腸菌群、大腸埃希氏菌解決方案！
- 乳與乳制品中需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定
單核細胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性
生物學(xué)特性：單核細胞增生李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌，營養(yǎng)需求不高，兼性厭氧。該菌觸酶陽性，有動力，具有溶血反應(yīng)、能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖和七葉苷，不能發(fā)酵甘露醇和木糖，MR-VP陽性。
流行學(xué)特征：單核細胞增生李斯特菌是一種人畜共患病原菌，它的臨床癥狀為菌血癥、腦膜炎及導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)。單核細胞增生李斯特菌廣泛分布存在于自然界，可以加熱殺死，但是對高濃度鹽和酸相對不敏感。它還能在冰箱溫度和真空包裝內(nèi)增殖，特別有風險的材料包括生或加工肉類、生牛奶產(chǎn)品、生或熏魚、預(yù)制沙拉和長期真空儲存的包裝食物。
單核細胞增生李斯特氏菌的國標檢驗方法
操作注意事項
1：對易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類）進行檢測時，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液；
2：預(yù)增菌時間與樣品種類、目標菌和雜菌的含量及狀態(tài)等因素有關(guān)。一般菌相比較復(fù)雜的高污染樣品，如果增菌時間過長會導(dǎo)致雜菌生長過多，目標菌可能就會被另一種優(yōu)勢菌所取代，這種情況下，增菌時間不宜過長。低污染樣品的增菌時間可以適當延長。由于本標準適用的樣品種類眾多，預(yù)增菌的時間應(yīng)根據(jù)實際情況和經(jīng)驗進行具體選擇。建議增菌液發(fā)生混濁時停止預(yù)增菌。
3：分離劃線用直徑3mm的接種環(huán)（1環(huán)約10微升）。
4：動力試驗的培養(yǎng)溫度不能超過30℃。
操作難點1-可疑菌落的識別
1）PALCAM培養(yǎng)基
可疑菌落特征：在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落,周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。
疑點：單核細胞增生李斯特氏菌與屬內(nèi)其他李斯特氏菌菌落特征無明顯差別，可疑菌落多，后續(xù)確證工作量大。
2）CRM014 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基
可疑菌落特征：單核細胞增生李斯特氏菌形成藍綠色規(guī)測光滑的小菌落，周圍有乳白色脂肪沉淀環(huán)；其他李斯特氏菌為藍綠色無暈圈菌落；雜菌被抑制或顯示其他顏色。
疑點：乳白色脂肪沉淀環(huán)擴散覆蓋其他菌落時極易引起假陽性。
操作難點一的解決方案：
1）CRM013 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基
可疑菌落特征：單核細胞增生李斯特氏菌形成藍綠色規(guī)測光滑的小菌落；其他李斯特氏菌為無色菌落；雜菌被抑制或顯示其他顏色。
李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基與單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的對比
CRM013 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基的優(yōu)勢
配制簡便：添加劑易溶，克服李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基配制不當所致暈圈特征不明顯問題，同時節(jié)省了時間和減少了勞動強度。
特異性極強：對于陰性菌有著很好的抑制作用；對于有害李斯特菌和無害李斯特菌，有著很好的分辨能力和靈敏度；
結(jié)果易讀：顏色清晰易辯，結(jié)果一目了然；
準確率高：能避免假陽性及假陰性結(jié)果。
操作難點二：可疑菌落鑒定
1）革蘭氏染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌。
2）動力試驗：李斯特氏菌有動力,在半固體或SIM培養(yǎng)基上方呈傘狀生長,如傘狀生長不明顯,可繼續(xù)培養(yǎng)5再觀察結(jié)果
3）過氧化氫酶試驗：李斯特氏菌過氧化氫酶陽性反應(yīng)
4）傳統(tǒng)生化試驗：七葉苷、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖磷酸鹽胨水（MR/VP）
5）溶血試驗：單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈；斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈；英諾克李斯特氏菌無溶血圈；伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域。若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24h~48h再觀察。
注意事項：穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24h~48h，于明亮處觀察。
6）協(xié)同溶血試驗cAMP（可選做項目）
實驗操作：在血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間，垂直線兩端不要觸及平行線，距離1~2mm，于36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h。
結(jié)果判讀：單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約2mm 的β-溶血增強區(qū)域，斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強區(qū)域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約5mm~10mm 的“箭頭狀”β-溶血增強區(qū)域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結(jié)果不明顯，可置4 ℃冰箱24h~48h再觀察。
操作難點二解決方案：
1）MID67李斯特氏菌鑒定系統(tǒng)
MID67 李斯特菌鑒定系統(tǒng)優(yōu)點
MID67 中的溶血試驗反應(yīng)，可替代傳統(tǒng)的血平板溶血試驗和CAMP
MID67 李斯特菌鑒定系統(tǒng)使用流程
最后將數(shù)值編碼輸入MID數(shù)據(jù)庫中檢索，即可獲得鑒定結(jié)果。
2）單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光PCR快檢法
產(chǎn)品：單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光PCR擴增試劑盒
技術(shù)原理：基于實時熒光PCR技術(shù)，針對檢測目標特異性基因片段設(shè)計引物和熒光探針并優(yōu)化反應(yīng)所需試劑組分，加入待檢樣品核酸即可進行擴增反應(yīng)。在擴增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強弱變化繪制出相應(yīng)的實時擴增曲線，進而判定目標基因是否檢出。
產(chǎn)品優(yōu)勢：快速提取，一步法核酸提取，快速高效，核酸提取效率高； 操作簡單，提供PCR反應(yīng)體系預(yù)混液，直接加樣檢測，無需自行配制； 特異性強，采用高特異性引物及探針，確保實驗準確性； 靈敏度高，采用高效的擴增酶，檢測靈敏度可達10-100copies/test。
產(chǎn)品組成：
組分名稱 | 規(guī)格×數(shù)量 |
| 預(yù)混液 | 1mL×1管 |
| 陽性對照 | 200μL×1管 |
| 陰性對照 | 200μL×1管 |
| 裂解液 | 1mL×2管 |
| 說明書 | 1份 |
質(zhì)量控制及疑難解析
一，質(zhì)量控制
1： 實驗室過程中，每批預(yù)增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。
2： 定期使用單核細胞增生李斯特氏菌ATCC19115菌種或等效的其他標準株，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當?shù)氖称窐悠愤M行陽性對照實驗驗證，污染劑量應(yīng)控制在10-100CFU/25g，并進行記錄，驗證實驗至少每2個月進行1次。
3：要求對使用的培養(yǎng)基和生化試劑每批均用GB4789.30-2016推薦的陽性和陰性對照標準菌種進行驗證，并做好記錄。
二，疑難解析
Q1： 為什么在沒有典型菌落時仍要挑取非典型菌落進行鑒定？
根據(jù)經(jīng)驗，有少數(shù)單核細胞增生李斯特氏菌在李斯特顯色平板上呈現(xiàn)非典型菌落。
Q2：為什么在PALCAM選擇性平板上挑取典型菌落，鑒定后非單核細胞增生李斯特菌的概率較高？
PALCAM是李斯特菌屬的選擇性平板，根據(jù)經(jīng)驗，環(huán)境存在較多的英諾克李斯特菌，應(yīng)結(jié)合顯色平板，挑取較多的典型菌落鑒定。
Q3：當3個及以上連續(xù)稀釋度的結(jié)果均為陽性時，如何選擇？
選擇原則參考Bacteriological Analytical Mannual Appendix 2: Most Probable Number form Serial Dilutions。
Q4：如果前增菌或選擇性增菌結(jié)束后，肉湯中未見微生物生長，是否可以終止實驗？
不可以，因為肉眼可見的細菌濃度為107CFU/mL，在此濃度以下，肉眼是不能發(fā)現(xiàn)。
所需培養(yǎng)基試劑
用途 | 貨號 | 名稱 | 規(guī)格 |
增菌液 | 026040 | 瓶（干粉）250g | |
SR0100 | 10支/盒 | ||
SR0110 | 10支/盒 | ||
| CP0490 | LB1增菌液 | 225ml × 6瓶 | |
| CP0500 | 李氏增菌肉湯LB2 | 10ml× 20支 | |
分離平板 | 026070 | 瓶（干粉）250g | |
SR0140 | 10支/盒 | ||
029980 | 盒（平板）90 mm×20 | ||
CRM014 | 1L用量（干粉） | ||
CRM014P1 | 盒（平板）90 mm×20 | ||
CRM013 | 1L用量（干粉） | ||
CRM013P1 | 盒（平板）90 mm×20 | ||
| 026020 | 胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE) | 瓶（干粉）250g | |
生化鑒定 | HKI008 | 10測試/盒 | |
核酸快速檢測試劑盒 | FZ007BF2 | 48測試/盒 | |
| 鑒定系統(tǒng) | HK-MID-67 | HK-MID李斯特菌鑒定系統(tǒng) | 10測試/盒 |
| 純培養(yǎng) | 026020A | 盒（平板）90 mm×20 | |
| 溶血試驗 | 024070 | 血平板 | 盒（平板）90 mm×20 |
