產(chǎn)品名稱：pSumo Expression Kit
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價格 |
| HKV105-01A | pSumo Expression Kit | 1μg/20次 | 表達(dá)載體 | 960 |
產(chǎn)品描述：
pSumo 專為目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)設(shè)計是預(yù)先用 Xho I，Sal I 線性化的載體，請配合 Plus PCR 一步定向克隆試劑盒（Cat.No：HKNR005）使用。外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)容易形成包涵體，使獲得有生物學(xué)活性的蛋白比較困難。常見表達(dá)載體往往由于蛋白表達(dá)過快，目標(biāo)蛋白來不及正確折疊而形成包涵體。該質(zhì)粒使用于阿拉伯糖誘導(dǎo)，有較強的劑量依賴性。合適的阿拉伯糖濃度能夠在保障表達(dá)效率的同時獲得高效的可溶蛋白。SUMO 融合標(biāo)簽可有效促進目標(biāo)蛋白的正確折疊，從而提高蛋白質(zhì)的可溶性，同時 SUMO Protease（Cat.No：HKPE002）是一種結(jié)構(gòu)特異性的蛋白酶，只切割有正確構(gòu)象的融合蛋白，因而可以準(zhǔn)確移除融合標(biāo)簽。
目的基因擴增按常規(guī)方法設(shè)計引物后，在上游引物 5′端前添加以下序列： CA GAT TGG AGG TCT CGA GATG；下游引物 5′ 端前添加：GAT GAT GAT GAT GAT GGT CGAC。
注意：5′端引物從第一個氨基酸不是甲硫氨酸 (ATG) 時，可使用 GAA CAG ATT GGA GGT。不希望目標(biāo)蛋白 C 端保留 His Tag 時 3′端引物需要加入終止密碼子。
產(chǎn)品特點：
SUMO 融合標(biāo)簽可有效促進目標(biāo)蛋白的正確折疊，提高蛋白質(zhì)的可溶性。
SUMO Protease 是一種結(jié)構(gòu)特異性的蛋白酶，準(zhǔn)確去除融合標(biāo)簽。
Plus PCR 一步定向克隆試劑盒操作簡便，完成質(zhì)粒構(gòu)建。
應(yīng)用實例：圖例）pSumo 載體促進融合蛋白表達(dá)。
泳道 1：誘導(dǎo)前；
泳道 2：誘導(dǎo)后；
泳道 M：Protein Marker。
保存溫度：-20℃
pSumo Expression Kit 產(chǎn)品包裝（A包裝）：
| 產(chǎn)品組成 | 體積 |
| pSumo（25ng/μl） | 40μl |
| Plus Recombinase | 20μl |
| 5×Reaction Buffer | 100μl |
| Control Insert（50ng/μl） | 10μl |
| SUMO Protease（1U/μl） | 100μl |
質(zhì)量保證：pSumo 線性化載體經(jīng)過嚴(yán)格的自連測試 以及連接效率測試，滿足下游實驗需求。
注意事項：
1）目的片段的 PCR 產(chǎn)物建議純化，避免引物二聚體等雜質(zhì)影響連接反應(yīng)。
2）目的片段與載體的摩爾比在 2：1。
3）引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp序列與線性化載體的兩端一致。
使用方法：
A 目的片段的獲得
目的片段通常通過 PCR 獲得。引物設(shè)計要保證目的片段兩端有至少 15bp 序列與線性化載體的兩端序列一致。為保證 PCR擴增的保真度，請盡可能選用高保真酶，推薦使用 Fast Pfu DNA 聚合酶（Cat.No:HKE031）。PCR 每條引物長度至少在 40- 45bp，包括 5'端與載體同源的 20bp 序列以及目的片段特異性20-25bp 序列。
（注意：如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計完成后，請注意 檢 查讀碼框是否正確。）
B 目的片段與載體的重組
C 轉(zhuǎn)化（我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要大于5×106 cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下：）
1，冰上融化一支感受態(tài)細(xì)胞，輕彈管壁使細(xì)胞重懸起來。加入 10μl 的反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中，用移液 槍吹打混合，冰上放置 30 分鐘。
2，將離心管置于 42℃水浴中，熱擊 60-90 秒，迅速將離心管置于冰上，放置 2-3 分鐘。
3，向每個離心管中加入 500μl 無菌不含抗生素的LB 或 SOC 培養(yǎng)基中，37℃搖床，150rpm 振蕩培養(yǎng) 45 分鐘，使質(zhì)粒上氨芐抗性基因表達(dá)，菌體復(fù)蘇。
4，吸取 200μl 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含氨芐青霉素的 LB 或 SOC 固體平板上，用無菌涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于 37℃培養(yǎng)箱里直至液體完全吸收，倒置培養(yǎng) 12-16 小時。
D 陽性克隆鑒定
PCR 檢測，利用高速 PCR 擴增試劑 2×Fast Taq Master Mix（Cat.No:HKE029）直接進行菌落 PCR 鑒定。
鑒定引物的選擇：為避免假陽性結(jié)果，我們建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。
pSumo 結(jié)構(gòu)圖：
| pBAD promoter | 3 - 277 |
| SUMO fusion Tag | 319 - 642 |
| rrnB Terminator | 711 - 1136 |
| Amp resistance | 1229 - 2089 |
| Pbr322 Ori | 2234 - 2907 |
| AraC CDS | 3438 - 4340 |
